意大利裔兄弟马力欧（克里斯·帕拉特 配音）和路易吉（查理·戴 配音）经营着一家小型管道维修公司，试图闯出一片天地。一天，他们在修理地下水管时被吸入一根神秘管道，马力欧来到蘑菇王国，而路易吉则落入黑暗之地，两人就此失散。蘑菇王国正面临库巴（杰克·布莱克 配音）的威胁，这只巨型乌龟率领军队入侵，抢夺超级星星，意欲征服世界。

马力欧在蘑菇王国遇到奇诺比奥（基根-迈克尔·凯 配音），并在碧姬公主（安雅·泰勒-乔伊 配音）的帮助下接受训练，试图掌握力量拯救弟弟。碧姬带领马力欧前往丛林王国，与大金刚（塞斯·罗根 配音）结盟，共同对抗库巴。路易吉则在黑暗之地被囚，与其他俘虏一起等待命运。最终，马力欧一行在彩虹之路与库巴展开激战，超级星星的力量被马力欧和路易吉夺回，两人联手击败库巴，救下王国。战斗结束后，兄弟俩回到布鲁克林，继续他们的管道事业，带着冒险的记忆迎接新生活。